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试剂盒（PSA）
DAS-ELISA，碱性磷酸酶标记物
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（请仔细阅读英文说明书，中文说明书仅供参考） 所有试剂及微孔板使用前均需回温到25℃左右
1. 试剂盒内组分
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项 目 |
96反应孔 |
288反应孔 |
480反应孔 |
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96孔包被抗体的微孔板 |
1 |
3 |
5 |
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碱性磷酸酶标记物 |
0.150ml |
0.350ml |
0.550ml |
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PNP底物片（5mg/片） |
12 |
12 |
25 |
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PNP底物缓冲液（5倍浓缩液） |
12ml |
12ml |
25ml |
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ECI缓冲液（5倍浓缩液） |
3ml |
6.5ml |
11ml |
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阳性质控物（冻干粉，瓶装） |
1 |
1 |
1 |
注意：以上物品需要在4℃环境下保存。
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反应停止液（3M NaOH） |
15ml |
15ml |
30ml |
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PBST洗涤缓冲液（20倍浓缩液，50ml） |
3 |
5 |
7 |
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吐温-20 |
15ml |
30ml |
30ml |
2. 样品提取缓冲液
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通用样品提取缓冲液 |
16.5g |
33g |
33g |
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越橘类样品提取缓冲液 |
22.2g |
44.4g |
44.4g |
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葡萄类样品提取缓冲液 |
49.5g |
98.8g |
98.8g |
注意：以上物品在常温下保存。
3. 操作者应该注意之事项
----按推荐的温度贮存试剂以确保其活性
----不要长期贮存1倍浓度的缓冲液
----应避免试剂直接接触眼睛或皮肤，如不慎接触到试剂，请立即清洗或到医院就诊
----实验前后请务必洗手
4. 需要的材料但盒中不提供
----样品提取用具（如研钵）
----密封塑料盒
----吸水纸
----蒸馏水
----微量移液管
5. 实验过程
5.1 准备工作
----1倍浓度的PBST缓冲液，样品提取缓冲液及质控物的制备，详见后附录
----实验前，在设计图表上注明各反应孔的位置，以避免出错
----在密封塑料盒底部铺一张吸水纸，倒入适量蒸馏水使之刚好润湿，即为恒湿箱，孵育用
----未使用完的微孔请密封好，4℃下保存。
5.2 样品的提取及稀释
5.2.1样品的提取
----尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验
----在1个反应孔中加入多片叶片的提取液会使实验更经济一些，但却降低了实验的灵敏度。如对样品提取有任何疑义请与本公司联系
----若用研钵提取样品，在每份样品提取后请彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染
----绝大多数样品，可使用通用样品提取缓冲液。但有些植物（葡萄、蓝莓等）必须使用特殊的提取缓冲液。如对样品提取缓冲液有任何疑义请与本公司联系
5.2.2样品的稀释
----样品研磨后，将样品提取液与提取缓冲液以1：10（样品提取液体积：提取缓冲液体积）的比例混合均匀。或以1：10（样品质量：提取缓冲液体积）的比例在提取缓冲液中研磨样品
----每个反应孔需要100ul的样品提取稀释液。多准备一些样品提取稀释液以利于吸取
5.3 点样及孵育
5.3.1点样
----根据实验设计图表，取100ul样品提取稀释液到各样品孔中
----取100ul样品提取缓冲液到缓冲液对照孔中
----取100ul阳性质控物溶液到阳性对照孔中
5.3.2孵育
----室温下（25℃），在恒湿箱中孵育2小时或在4℃条件下过夜
5.4 酶标记物的制备
----将ECI缓冲液稀释到1倍
----根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物加到1倍的ECI缓冲液中，混合均匀
----根据使用量来确定酶标记物稀释液的体积
注意：1ml的酶标记物稀释液足够8个反应孔使用，10ml的酶标记物稀释液够96个反应孔使用。
酶标记物请在孵板结束前的10分钟内制备完成。
制备过程请使用清洁的、未使用过的移液管。
5.5 洗板
----孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出
----加入250ul的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复4-8次
----将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体
5.6 加酶标记物稀释液及孵育
5.6.1加酶标记物稀释液
----在各反应孔中加入100ul酶标记物稀释液
5.6.2孵育
----室温下（25℃），在恒湿箱中孵育2小时
5.7 PNP底物的制备
孵育结束前的15分钟制备PNP底物溶液。在室温下用5ml PNP缓冲液溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5ml的底物溶液，溶解比例为1mg/ml，大约够40个反应孔使用。在室温下用5ml PNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。
注意：请勿直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下，直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。
5.8 洗板、加PNP底物溶液及孵育
5.8.1洗板
----步骤同上
5.8.2加PNP底物溶液
----在各反应孔中加入100 ul PNP底物溶液
5.8.3孵育
----在恒湿箱中孵育30-60分钟
5.9 终止反应
----孵育结束后，在各反应孔中加入50ul 3M的NaOH 终止反应。这一步可以选做
6. 结果
直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果
阳性结果：微孔中有明显颜色变化
阴性结果：微孔中没有明显颜色变化
注意：只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。结果可保持1小时左右。（只要阴性质控孔不发生颜色变化）。
7. 质控物溶液的制备
----根据质控物瓶上标签所示比例，用样品提取缓冲液（种类与提取样品时相同）溶解阳性质控物干粉，轻轻摇匀
注意：质控物干粉需在4℃条件下贮存。
----根据需要将阳性质控物溶液分成若干小份
----如每次实验只需1个阳性对照孔，可将质控物溶液分成
120ul/份的小样。如需2个对照孔，则分成220ul/份的小样。冷冻保存
----在使用前完全回温后使用
注意：阳性质控物溶液需在-20℃条件下冷冻保存，且在使用前必须完全回温。（用手感觉到不凉）
不得重复冷冻已融化的指控物溶液。
所提供的质控物只推荐用于ELISA实验。
附： 缓冲液的制备
1. 制备PBST缓冲溶液
用蒸馏水将试剂盒提供的PBST浓缩液稀释成1倍 PBST。1倍 PBST的缓冲液只能保存1天。
2. 缓冲液干粉
样品提取缓冲液可直接用缓冲液干粉来配置。
注意：每次实验只制备当天测定所需量的样品提取缓冲液。
2.1制备通用样品提取缓冲液
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缓冲液干粉 |
16.5g |
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蒸馏水 |
500ml |
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吐温-20 |
10.0g |
先在干粉中加入10ml蒸馏水，混合均匀，再加入余下的蒸馏水，加入吐温-20，混合均匀。可在4℃-6℃下保存3个月。
注意：如需要，可在7.2-7.8范围内调整pH值。
2.2制备越橘（蓝莓）类样品提取缓冲液
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缓冲液干粉 |
22.2g |
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蒸馏水 |
500ml |
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吐温-20 |
10.0g |
先在干粉中加入10ml蒸馏水，混合均匀，再加入余下的蒸馏水，加入吐温-20，混合均匀。
2.3制备葡萄类样品提取缓冲液
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缓冲液干粉 |
98.8g |
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蒸馏水 |
1000ml |
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吐温-20 |
0.5g |
先在干粉中加入10ml蒸馏水，混合均匀，然后加入800ml蒸馏水，再加入吐温-20，混合均匀。之后用盐酸调整pH值到8.2，加入余下的蒸馏水，混合均匀。
3. 缓冲液组成成分（试剂盒中提供，提供成分以供参考）
3.1通用样品提取缓冲液组成成分
用1000ml 1倍的PBST溶解以下物质
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亚硫酸钠（无水） |
1.3g |
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聚乙烯吡咯烷酮（PVP）MW24-40,000 |
20.0g |
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叠氮化钠 |
0.2g |
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鸡蛋清粉（2级） |
2.0g |
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吐温-20 |
20.0g |
注意：调整pH值到7.4，4℃下贮存。
3.2越橘（蓝莓）类样品提取缓冲液组成成分
用1000ml通用样品提取缓冲液溶解以下物质
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磷酸氢钠（无水） |
10.4g |
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磷酸二氢钾（无水） |
0.9g |
注意：4℃下贮存。
3.3葡萄样品提取缓冲液组成成分
用900ml 蒸馏水稀释以下物质
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三羟甲基氨甲烷 |
60.5g |
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氯化钠 |
8.0g |
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聚乙烯吡咯烷酮（PVP）MW24-40,000 |
20.0g |
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二乙醇胺 |
10.0g |
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叠氮化钠 |
0.2g |
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吐温-20 |
0.5g |
注意：用盐酸调整pH值到8.2，再用蒸馏水定容到1000ml。
4℃下贮存。
3.4 PBST缓冲液（洗涤缓冲液）组成成分
用1000ml蒸馏水稀释以下物质
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氯化钠 |
8.0g |
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磷酸氢钠（无水） |
1.15g |
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磷酸二氢钾（无水） |
0.2g |
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氯化钾 |
0.2g |
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吐温—20 |
0.5g |
注意：调整pH值到7.4。
3.5 ECI缓冲溶液
用1000ml 1倍 PBST稀释以下物质
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牛血清蛋白（BSA） |
2.0g |
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聚乙烯吡咯烷酮（PVP）MW24-40,000 |
20.0g |
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叠氮化钠 |
0.2g |
注意：调整pH到7.4，4℃下保存。
3.6 PNP缓冲液
用800ml蒸馏水稀释以下物质
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MgCl2·6H2O |
0.1g |
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叠氮化钠 |
0.2g |
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二乙醇胺 |
97.0ml |
注意：用盐酸将pH值调为9.8，再用蒸馏水定容到1000ml。
4°C下贮存。