上海必优生物科技有限公司

使用说明

鸡败血性支原体抗体检测试剂盒

Mycoplasma Gallisepticum Antibody Test Kit (MG)

Synbiotics辛百克斯（96-6533）

用途

鸡败血性支原体（MG）抗体检测试剂盒用于快速检测鸡血清或蛋黄中MG抗体。

试剂盒成份和数量

a) 包被MG抗原的酶标板                          10块

b) MG阳性血清对照（+）                          0.2ml（用前1：100稀释）

c) 阴性血清对照 （-）                           0.2ml（用前1：100稀释）

d) 洗涤液                                        200ml（用前1：20稀释）

e) 羊抗鸡酶标二抗IgG酶标记物                    1.7ml（用前1：100稀释）

f) 终止液                                        25ml（用前1：5稀释）

g) 样品稀释液                                    200ml×2（直接使用）

h) 氢化ABTS 底物溶液                             100ml（直接使用）

需自备器材

准确的移液器、量筒、试管、96孔稀释板、双蒸水或去离子、酶标仪、洗板机

样品和试剂稀释步骤（一块96孔酶标板的使用量）

A、 血清 用样品稀释液作两次1：10（10ul血清+90ul样品）稀释，终稀释100倍；

B、 阳性血清对照 在离心管里加500ul样品稀释液，再加5ul阳性对照充分混匀；

C、 阴性血清对照 在离心管里加500ul样品稀释液，再加5ul阴性对照充分混匀；

D、 洗涤液 用20ml洗涤液加380ml，混匀；

E、  酶标记物 100ul酶标记物加10ml样品稀释液，混匀；

F、 终止液 2.5ml终止液加10ml实验室级水混匀（注意：5倍终止液冷藏保存时可能会产生白色固体，这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用）。

ELISA检测步骤

a)     事先画好表格并标记待检样品和阴、阳性对照的位置，取出一块酶标板，相应做好标记；

b)     将稀释好的阳性对照加入A1、A3和H11孔，100ul/孔；

c)     将稀释好的阴性对照加入A2、H10和H12孔，100ul/孔；

d)     将稀释好的待检样品加入到相应孔内，100ul/孔；

e)     室温孵育30分钟。

f)     每孔加入300ul稀释好的洗涤液，允许浸泡3分钟，倒出洗液，在吸水纸上拍板，确保无残留。再重复以上步骤2-3遍。

g)     加入稀释好的酶标记物，100ul/孔；

h)     室温孵育30分钟；

i)     同f洗涤；

j)     加入底物，100ul/孔 (注意：底物本来无色，如变色则不能使用) ；

k)     室温孵育15分钟；

l)     加入稀释好的终止液，100ul/孔；

m)     用酶标仪在405~410nm波长下读板（读板前确保每孔无气泡）。

结果

实验的有效性：

只有当阴性对照算术平均值小于0.200，阳性对照矫正值在0.250-0.900之间，测定结果才有效；如果二者中任何一个不在范围内，则测定结果无效，需重新检测。如果待检样品的SP值小于或等于0.199，则视其抗体滴度为0，或MG抗体阴性。

值的范围：阴性对照在0.060-0.120，阳性对照值在0.350-0.750，才能确保实验结果的一致性。请注意如果检测结果不在以上范围内，不等同于检测结果无效。

结果的计算：

a)     阳性平均值（PCX）：PCX=（A1+A3+H11）/3

b)     阴性平均值（NCX）：NCX=（A2+H10+H12）/3

c)     S/P值：S/P=(样品OD值-NCX)/(PCX-NCX)

d)     抗体滴度的换算关系：  Log₁₀滴度=（1.464×log₁₀SP）+3.197

结果分析：

SP临界值：辛百克斯每种ELISA检测试剂盒都有一个与阳性血清对照对应的SP临界值，用这个SP临界值可以很清楚地去区分阳性样品与阴性样品，MG-ELISA检测试剂盒的SP临界值如下：

               SP 临界值               效价范围         阴阳性判定

≤0.199                  0                阴性

 0.200≤SP≤ 0.599          149-743             可疑

≥0.600                ≥744               阳性

MG抗体滴度为0，说明该样品中本试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的MG特异性抗体；待检血清中出现MG抗体滴度大于744的样品，说明该样品相对MG-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说有明显的MG抗体。然而，我们不知道该MG抗体水平对鸡群是否有保护性，也分辨不出该MG抗体是由疫苗免疫产生的还是野毒感染所致。

理想的MG的疫苗免疫程序和什么样的抗体水平对鸡群有保护，是由实验人员通过比较疫苗免疫前后MG抗体水平和鸡群的临床表现来判定的。

注意事项

好的实验结果必须遵守实验操作规则，使用好的安全实验技术；所有试剂和样品都要视为生物安全材料处理；试剂盒中的试剂如果已经过期，不要使用；使用过的洗液，对照血清，检测板，检测样品和其它检测试剂必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理；所有试剂不要被血清和细菌污染；每块酶标板都有湿度显示，如果显示出粉红色，板则需清理（漂白剂清洗）或无害化处理；谨防试剂溅到眼睛和皮肤，一旦溅到，立即用凉水冲洗干净；不要用嘴对着吸管吸取试剂瓶内的试剂。

试剂盒内所有组份需在2~7℃保存；在开始实验前，所有的检测试剂必须回温至室温（21℃-24℃）！实验温度：70-75℉，即21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。