上海必优生物科技有限公司

RIDASCREEN® CIS-Casein
Enzymimmunoassay zur Bestimmung von
Kuhcasein
Enzyme immunoassay for the analysis of
bovine casein
Art. No.: R5102
In vitro Test
Lagerung bei 2 - 8 °C
Storage at 2 - 8 °C
RIDA® und RIDASCREEN®
sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm AG
Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland
R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert.
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RIDA® and RIDASCREEN®
are registered trademarks of R-Biopharm AG
Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
R-Biopharm AG is ISO 9001 certified.
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Kurzinformation
RIDASCREEN® CIS-Casein (Art. Nr.: R5102) ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay
zur Bestimmung von Kuhcasein in Schaf- und Ziegenmilch, -käse und
-joghurt.
Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards
- sind im Testkit enthalten.
Ein Testkit ist ausreichend für 48 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen).
Zur Auswertung benötigt man ein Mikrotiterplatten-Photometer.
Probenvorbereitung: homogenisieren und extrahieren
zentrifugieren / trocknen (Aceton)
Zeitbedarf: Probenvorbereitung (für 10 Proben) ...............ca. 2 h
Testdurchführung (Inkubationszeit) ...................2,5 h
Nachweisgrenze: in Käse: ........................................ 0,5 % Kuhcasein
Spezifität: Die in dem RIDASCREEN® CIS-Casein-Test eingesetzten
Antikörper reagieren monospezifisch mit
bovinem g-Casein. Die Antikörper erkennen gleichermaßen
g1-, g2-, g3- und b-Caseine.
Es wurde keinerlei Kreuzreaktion der gereinigten
Antikörper zu Schaf- oder Ziegenmilchprotein-
Fraktionen beobachtet, jedoch besteht Kreuzreaktivität
gegenüber Büffelcasein. Deshalb ist das Verfahren zur
Untersuchung von Büffelmilch enthaltenden Produkten
nicht geeignet.
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1. Verwendungszweck
RIDASCREEN® CIS-Casein ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur
Bestimmung von Kuhcasein in Schaf- und Ziegenmilch, -käse und -joghurt.
2. Allgemeines
Die Herstellung von Käse aus Schaf- und Ziegenmilch hat in der Europäischen
Gemeinschaft, besonders in Frankreich, Spanien, Italien und Griechenland, eine
wirtschaftliche Bedeutung.
Die Produktion von Schaf- und Ziegenmilch unterliegt jedoch großen jahreszeitlichen
Schwankungen, und um jahreszeitlich bedingte Minderproduktion zu überbrücken,
ist der Zusatz von Kuhmilch bei der Käseproduktion aus wirtschaftlichen
Gründen interessant.
Neben der EU-Verordnung Nr. 213/2001 der Kommission, in der die isoelektrische
Fokussierung als Nachweismethode für g-Casein beschrieben wird, besteht mit
dem RIDASCREEN® CIS-Casein-Test die Möglichkeit, sehr spezifisch und
sensitiv bovines g-Casein in Milch, Käse und Yoghurt nachzuweisen.
Im Vergleich zu der isoelektrischen Fokussierung, die zeitaufwändig ist und einen
speziellen technischen Aufwand erfordert, ist der ELISA einfach zu handhaben,
sehr sensitiv und sehr spezifisch.
3. Testprinzip
Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
sind mit Kuhcasein beschichtet. Zugegeben werden anti-Casein-Antikörper
und Standards bzw. Proben. Freies und immobilisiertes Casein konkurrieren um
die Casein-Antikörper-Bindungsstellen (kompetitiver Enzymimmunoassay). Nach
einem Waschschritt werden Peroxidase-markierte Sekundärantikörper (Enzymkonjugat)
zugegeben, die an die gebundenen anti-Casein-Antikörper binden. Nicht
gebundenes Enzymkonjugat wird anschließend in einem Waschschritt wieder
entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat (Harnstoffperoxid) und
Chromogen (Tetramethylbenzidin). Das an den Antikörper gebundene Enzymkonjugat
wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des
Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung
erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion der Lösung ist umgekehrt
proportional zur Kuhcasein-Konzentration in der Probe.
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4. Packungsinhalt
Mit den Reagenzien einer Packung können 48 Bestimmungen durchgeführt
werden (einschließlich Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält:
1 x Mikrotiterplatte mit 48 Kavitäten (6 Streifen à 8 Einzelkavitäten)
beschichtet mit g-Casein
3 x Standardlösungen (je 1,3 ml)
0 %, 0,5 %, 1 % Kuhcasein
in wässriger Lösung, gebrauchsfertig
1 x Konjugat (6 ml).................................................................... roter Verschluss
Peroxidase markierte Sekundärantikörper
gebrauchsfertig
1 x Antikörper (3 ml).......................................................... schwarzer Verschluss
Anti-Casein-Antikörper, gebrauchsfertig
1 x Substrat (7 ml) .................................................................. grüner Verschluss
enthält Harnstoffperoxid
1 x Chromogen (7 ml) ............................................................. blauer Verschluss
enthält Tetramethylbenzidin
1 x Stopp-Reagenz (14 ml) ..................................................... gelber Verschluss
enthält 1 N Schwefelsäure
1 x Puffer (60 ml)
Probenverdünnungspuffer als Konzentrat (10 x)
5. Zusätzlich benötigte Reagenzien – erforderliches Zubehör
5.1. Geräte:
− Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm)
− Stomacher oder Stabhomogenisator
− Ultraschallbad
− Zentrifuge und Zentrifugenbecher oder zentrifugierbare Reagenzgläser
− Faltenfilter
− Spatel
− Reibschale
− variable 20 - 200 μl und 200 - 1000 μl Mikropipetten
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5.2. Reagenzien:
− Aceton
− Ammoniak (25 %)
− Essigsäure (96 %)
− 1 M Ammoniumacetat-Puffer, pH 4,6:
ca. 800 ml dest. Wasser in ein geeignetes Gefäß vorlegen und mit 67 ml
Essigsäure (96 %) mischen, 43 ml Ammoniak (25 %) hinzugeben und mischen,
pH kontrollieren, ggf. mit verdünnter Essigsäure oder Ammoniaklösung auf pH
4,6 einstellen und auf 1000 ml dest. Wasser auffüllen
− 1 mM Ammoniumacetat-Puffer pH 4,6:
1 M Ammoniumacetat-Puffer mit dest. Wasser im Verhältnis 1:1000 (1+999)
verdünnen, pH ggf. mit verdünnter Essigsäure oder Ammoniaklösung
korrigieren
6. Vorsichtsmaßnahmen
Das Stopp-Reagenz enthält 1 N Schwefelsäure (R36/38, S2-26).
7. Reagenzien und ihre Lagerung
Die Reagenzien bei 2 - 8 °C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall
einfrieren.
Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut
verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2 - 8 °C lagern.
Die farblose Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung
vermeiden.
Nach Ablauf des Verfallsdatums (siehe Testkit-Außenetikett unter Expiration)
kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden.
Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern
ist nicht zulässig.
8. Anzeichen für Reagenzienverfall
− bläuliche Färbung der Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten
− Extinktion kleiner 0,6 (E450 nm < 0,6) für den Nullstandard
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9. Probenvorbereitung
Die Proben sind kühl und trocken zu lagern.
Der Probenverdünnungspuffer ist im Kit als Konzentrat enthalten. Vor dem Gebrauch
muss der Puffer 1:10 (1+9) mit dest. Wasser verdünnt werden (siehe
10.1.).
9.1. Caseinisolierung aus Käse und Joghurt
− die einer Trockenmasse von 2,5 g entsprechende Menge Käse oder Joghurt in
einen Zentrifugenbecher einwiegen
− 30 ml 1 M Ammoniumacetat-Puffer, pH 4,6 zugeben
− mit einem Stomacher oder Stabhomogenisator bei 8000 - 10000 U/min homogenisieren
− pH-Wert kontrollieren, ggf. mit Essigsäure (25 %) auf pH 4,6 nachstellen
− zentrifugieren: 5 min / 3000 g / Raumtemperatur (20 - 25 °C)
− Fett und Molke abgießen, Fettreste mit einem Labortuch vom Becherrand entfernen
− den Casein-Rückstand in 30 ml 1 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 4,6
homogenisieren
− pH-Wert kontrollieren, ggf. mit Essigsäure (25 %) auf pH 4,6 nachstellen
− zentrifugieren: 5 min / 3000 g / Raumtemperatur (20 - 25 °C)
− Fett und Molke abgießen, Fettreste mit einem Labortuch vom Becherrand entfernen
− den Casein-Rückstand mit ca. 30 ml Aceton homogenisieren und die Suspension
über einen schnellaufenden Faltenfilter filtrieren
− den Caseinrückstand dreimal mit je ca. 20 ml Portionen kaltem Aceton auf dem
Filter waschen
− den entfetteten Caseinrückstand auf dem Filter mit einem Spatel verteilen,
trocknen lassen und gelegentlich mit dem Spatel verreiben
− in einer Reibschale abschließend fein verreiben, trocken und lichtgeschützt
aufbewahren
− Caseinisolate mit einer Konzentration von c = 1 mg/ml in verdünntem Probenpuffer
(siehe 10.1.) suspendieren, diese Lösungen stets frisch ansetzen
− 10 min im Ultraschallbad inkubieren
− 50 μl pro Kavität im Test einsetzen
Anmerkung:
Die Caseinisolierung nach Referenzmethode EU VO Nr. 213/2001 der Kommission
bzw. L01.00 - 39 § 35 LMBG ist ebenfalls anwendbar.
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9.2. Caseinisolierung aus Milch
− 25 ml Milch mit 30 ml 1 M Ammoniumacetat-Puffer mischen, ggf. mit Essigsäure
auf pH 4,6 nachstellen und wie unter 9.1. beschrieben weiter verfahren
10. Testdurchführung
10.1. Testvorbereitungen
Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20 - 25 °C) bringen.
Die Standards liegen in folgenden Konzentrationen vor:
1. Standard 1 ..........................................................................0 % Kuhcasein
(CRM 599, Kommissionsinstitut für Referenzmaterialien und Messwesen,
B-2440 Geel, Belgien)
2. Standard 2 ....................................................................... 0,5 % Kuhcasein
(Isolat; wurde an EU-Referenzmaterial angeglichen)
3. Standard 3 ..........................................................................1 % Kuhcasein
(CRM 599, Kommissionsinstitut für Referenzmaterialien und Messwesen,
B-2440 Geel, Belgien)
Der Probenverdünnungspuffer liegt als 10fach-Konzentrat vor. Vor Benutzung
ist das Pufferkonzentrat 1:10 (1+9) mit dest. Wasser zu verdünnen (60 ml
Konzentrat ergeben 600 ml gebrauchsfertige Pufferlösung); immer nur soviel
Pufferkonzentrat einsetzen, wie unmittelbar benötigt wird.
10.2. Testdurchführung
Sorgfältiges Waschen ist sehr wichtig. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen
den Arbeitsschritten vermeiden.
1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und
Proben in Doppelbestimmung benötigt werden. Die Positionen der Standards
und der Proben protokollieren.
2. Je 50 μl der Standardlösung bzw. der nach Abschnitt 9 vorbereiteten Proben
als Doppelbestimmung in die entsprechenden Kavitäten pipettieren.
3. Je 50 μl der anti-Casein-Antikörperlösung in die Kavitäten pipettieren,
vorsichtig manuell mischen und 1 h bei Raumtemperatur (20 - 25 °C)
inkubieren.
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4. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit
durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen
Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 μl dest. Wasser waschen.
Diesen Vorgang zweimal wiederholen.
5. Je 100 μl der Enzymkonjugatlösung in die entsprechenden Kavitäten
pipettieren und 1 h bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) inkubieren.
6. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit
durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf saugfähigen
Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 μl dest. Wasser waschen.
Diesen Vorgang zweimal wiederholen.
7. Je 50 μl Substrat und je 50 μl Chromogen in die Kavitäten pipettieren.
Vorsichtig manuell mischen und 30 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) im
Dunkeln inkubieren.
8. Je 100 μl Stopp-Reagenz in jede Kavität pipettieren und vorsichtig manuell
mischen. Die Extinktion bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Zugabe des
Stopp-Reagenzes messen.
11. Auswertung
Durch die Verwendung der einheitlichen Caseinisolate können alle Proben unabhängig
von dem Proteingehalt durch Vergleich mit den drei Standardproben
bezüglich ihres Kuhmilchgehaltes beurteilt werden. Als Beurteilungsgrundlage
eines eventuellen Kuhmilchanteiles sei auf die EU-Verordnung 213/2001 zur
Festlegung einer Referenzmethode zum Kuhmilchnachweis verwiesen.
Eine Probe ist negativ im Sinne eines Kuhmilchanteiles zu beurteilen, wenn:
E450 nm {Standard 1 (0 %)}³ E450 nm {Probe} > E450 nm {Standard 2 (0,5 %)}
Eine Probe ist positiv im Sinne eines Kuhmilchanteiles zu beurteilen, wenn:
E450 nm {Probe} £ E450 nm {Standard 3 (1 %)}
Eine Mitverwendung von Kuhmilch kann dann angenommen werden, wenn:
E450 nm {Standard 3 (1 %)} < E450 nm {Probe} < E450 nm {Standard 2 (0,5 %)}
In diesem Fall ist eine Nachuntersuchung mit der Referenzmethode anzuraten.
Die Unterschiede in den Extinktionswerten zwischen Standard 1 (0 %) und Standard
3 (1 %) sollte mindestens 0,5 betragen.
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0 % 0.5 % 1 %
Casein
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.5
OD 450 nm
Abb. 1: Extinktionen für die Standards eines RIDASCREEN® CIS-Casein-Tests
Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und
sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten
informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften
der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck
zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die
standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt.
Darüber hinaus gehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder
Kosten aus der Nutzung der Produkte entstehen nicht.
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RIDASCREEN® CIS-Casein
Brief information
RIDASCREEN® CIS-Casein (Art. No.: R5102) is a competitive enzyme
immunoassay for the analysis of bovine casein in ewes’ and goats’ milk, cheese
and yogurt.
All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are
contained in the test kit.
The test kit is sufficient for 48 determinations (including standards).
A microtiter plate spectrophotometer is required for quantification.
Sample preparation: homogenization and extraction
centrifugation / drying (acetone)
Time requirement: sample preparation (for 10 samples) .......approx. 2 h
test implementation (incubation time) ................2.5 h
Detection limit: in cheese: ................................ 0.5 % bovine casein
Specificity: The antibodies used in the RIDASCREEN® CISCasein
assay are monospecific against bovine
g-casein. The antibodies recognize bovine g1-, g2-, g3-
and b-caseins to a similar extent.
No cross reactivity of the purified antibodies against
ewes’ and goats’ milk protein fractions were observed,
but the antibodies cross react with buffalo casein.
Therefore the test must not be applied for the
detection of cows’ milk products containing buffalos’
milk.
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1. Intended use
RIDASCREEN® CIS-Casein is a competitive enzyme immunoassay for the
analysis of bovine casein in ewes’ and goats’ milk, cheese and yogurt.
2. General
The production of ewes’ and goats’ cheese is of economical importance in the
European Community, especially for France, Spain, Italy and Greece.
But as the production of ewes’ and goats’ milk depends on the season of the year,
getting over the restricted production with the addition of cows’ milk in cheese
production is of economical interest.
In addition to the reference method (Reg. No. 213/2001) of the European
Commission, in which the isoelectric focusing of bovine g-casein is
recommended, the RIDASCREEN® CIS-Casein assay provides a method for
more specific and sensitive bovine g-casein detection in milk, cheese and yogurt.
In comparison to the isoelectric focusing, which is time consuming and requires
special equipment, the ELISA is easy to handle, very sensitive and also very
specific.
3. Test principle
The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The microtiter wells are
coated with bovine casein. Anti-casein antibodies and standards, respectively
sample solution, are added. Free and immobilized bovine casein compete for the
antibody binding sites. After washing, secondary antibodies labeled with
peroxidase (enzyme conjugate) are added. These bind to the antibody bovine
casein complexes. Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing
step. Enzyme substrate (urea peroxide) and chromogen (tetramethylbenzidine)
are added to the wells and incubated. Bound enzyme conjugate converts the
chromogen into a blue product. Addition of the stop solution causes a color
change from blue to yellow. The measurement is done photometrically at 450 nm.
The resulting absorbance values are inversely proportional to the bovine casein
concentration in the sample.
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4. Reagents provided
Each kit contains sufficient materials for 48 measurements (including standard
analyses). Each test kit contains:
1 x Microtiter plate, (6 strips with 8 removable wells each),
48 wells coated with bovine g-casein
3 x Standard solutions (1.3 ml each)
0 %, 0.5 %, 1 % bovine casein
in aqueous solution, ready to use
1 x Conjugate (6 ml) .................................................................................red cap
peroxidase conjugated secondary antibodies
ready to use
1 x Antibody (3 ml) ................................................................................black cap
anti-casein antibody, ready to use
1 x Substrate (7 ml) ..............................................................................green cap
contains urea peroxide
1 x Chromogen (7 ml)............................................................................. blue cap
contains tetramethylbenzidine
1 x Stop solution (14 ml)...................................................................... yellow cap
contains 1 N sulfuric acid
1 x Buffer (60 ml)
sample dilution buffer as concentrate (10 x)
5. Reagents required but not provided
5.1. Equipment:
− microtiter plate spectrophotometer (450 nm)
− stomacher or ultra-turrax
− ultrasonic bath
− centrifuge and centrifuge beaker or centrifugal tubes
− filter
− spatula
− mortar
− variable 20 - 200 μl and 200 - 1000 μl micropipettes
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5.2. Reagents:
− acetone
− ammonia solution (25 %)
− glacial acetic acid (96 %)
− 1 M ammoniumacetate buffer, pH 4.6:
fill approx. 800 ml dist. water into a suitable flask and mix with 67 ml glacial
acetic acid (96 %), add 43 ml ammonia (25 %) and mix, eventually adjustment
to pH 4.6 by either diluted acetic acid or ammonia if required and fill up to
1000 ml with dist. water
− 1 mM ammoniumacetate buffer, pH 4.6:
dilute 1 M ammoniumacetate buffer 1:1000 (1+999) with dist. water, eventually
adjustment to pH 4.6 by either diluted acetic acid or ammonia if required
6. Warnings and precautions for the users
The stop solution contains 1 N sulfuric acid (R36/38, S2-26).
7. Storage instructions
Store the kit at 2 - 8 °C (35 - 46 °F). Do not freeze any test kit components.
Return any unused microwells to their original foil bag, reseal them together with
the desiccant provided and further store at 2 - 8 °C (35 - 46 °F).
The colorless chromogen is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct
light.
No quality guarantee is accepted after the expiration date on the kit label.
Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers.
8. Indication of instability or deterioration of reagents
− any bluish coloration of the chromogen solution prior to test implementation
− a value of less than 0.6 absorbance units (A450 nm < 0.6) for the zero standard
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9. Preparation of Samples
Store samples at a cool and dry place.
The sample dilution buffer is provided as a concentrate. Before use the buffer has
to be diluted 1:10 (1+9) with distilled water (see 10.1.).
9.1. Isolation of casein from cheese and yogurt
− weigh 2.5 g of cheese or yogurt (corresponding to the dry matter) in a centrifuge
beaker
− add 30 ml 1 M ammoniumacetate buffer, pH 4.6
− homogenize with a stomacher or ultra-turrax (8000 - 10000 rpm)
− if necessary, adjust to pH 4.6 by addition of acetic acid (25 %)
− centrifuge: 5 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F)
− discard fat and whey, remove fatty residues from the wall of the beaker carefully
with a laboratory cloth
− homogenize casein residue with 30 ml of 1 mM ammoniumacetate buffer,
pH 4.6
− if necessary, adjust to pH 4.6 by addition of acetic acid
− centrifuge: 5 min / 3000 g / room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F)
− discard fat and whey, remove fatty residues from the wall of the beaker carefully
with a laboratory cloth
− homogenize casein residue with ca. 30 ml acetone and filtrate suspension with
a highspeed filter
− wash casein residue on the filter three times each with 20 ml of cold acetone
− spread defatted casein residue on the filter by a spatula and leave to dry with
occasionally stirring the residue with spatula
− finally, grind the casein in a small mortar and store under dry and light protected
conditions
− suspend casein isolate with a concentration of c = 1 mg/ml in diluted sample
dilution buffer (see 10.1.), only use freshly prepared sample solutions
− incubate for 10 min in an ultrasonic bath
− use 50 μl per well in the assay
Remark:
Isolation of casein according to reference method EU Reg. No. 213/2001 of
the European Commission respectively L 01.00 - 39 § 39 LMBG can also be
applied.
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9.2. Isolation of casein from milk
− mix 25 ml of milk with 30 ml of 1 M ammoniumacetate-buffer, adjust to
pH 4.6 with acetic acid if necessary and isolate casein according to the
procedure described in 9.1.
10. Test implementation
10.1. Preliminary comments
Bring all reagents to room temperature (20 - 25 °C / 68 - 77 °F) before use.
The standards are provided in the following concentrations:
1. Standard 1 .................................................................... 0 % bovine casein
(CRM 599, Institute of commission for reference material and measurement,
B-2440 Geel, Belgium)
2. Standard 2 ................................................................ 0.5 % bovine casein
(Isolate; adjusted to the EU reference material)
3. Standard 3 ................................................................... 1 % bovine casein
(CRM 599, Institute of commission for reference material and measurement,
B-2440 Geel, Belgium)
The sample dilution buffer is provided as a 10fold-concentrate. Before use the
buffer concentrate has to be diluted 1:10 (1+9) with distilled water (60 ml
concentrate for 600 ml ready to use buffer); only the amount of buffer concentrate,
which actually is needed, should be diluted.
10.2. Test procedure
Carefully follow the recommended washing procedure. Do not allow microwells to
dry between working steps.
1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards
and samples to be run in duplicate. Record standard and sample positions.
2. Add 50 μl of each standard solution or prepared sample to separate duplicate
wells.
3. Add 50 μl of the anti-casein antibody solution to each well. Mix gently by
shaking the plate manually and incubate for 1 h at room temperature (20 -
25 °C / 68 - 77 °F).
4. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down
vigorously (3 times in a row) against absorbent paper to ensure complete
RIDASCREEN® CIS-Casein 07-09-12 17
removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 μl of distilled water
and pour out the liquid again. Repeat 2 more times.
5. Add 100 μl of the enzyme conjugate to each well. Mix gently by shaking the
plate manually and incubate for 1 h at room temperature (20 - 25 °C /
68 - 77 °F).
6. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down
vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete
removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 μl of distilled water
and pour out the liquid again. Repeat two more times.
7. Add 50 μl of substrate and 50 μl of chromogen to each well. Mix gently by
shaking the plate manually and incubate for 30 min at room temperature
(20 - 25 °C / 68 - 77 °F) in the dark.
8. Add 100 μl of the stop solution to each well. Mix gently by shaking the plate
manually and measure the absorbance at 450 nm. Read within 30 minutes
after addition of stop solution.
11. Results
By use of the standardized casein isolates, the presence of cows’ milk in unknown
samples can be easily detected by comparison with the three standard samples,
independently of the protein content.
For judgement of eventual cows’ milk content, the Commission Regulation
213/2001 is referred.
A sample is considered to be negative in containing cows’ milk if:
A450 nm {standard 1 (0 %)} ³ A450 nm {sample} > A450 nm {standard 2 (0.5 %)}
A sample is then considered to be positive in containing cows’ milk if:
A450 nm {sample} £ A450 nm {standard 3 (1 %)}
In cases, where the presence of cows’ milk must be assumed:
A450 nm {standard 3 (1 %)} < A450 nm {sample} < A450 nm {standard 2 (0.5 %)}
In this case the reference method should be applied if additional information is
required.
The differences of the extinction values between standard 1 (0 %) and standard 3
(1 %) should be at least 0.5.
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0 % 0.5 % 1 %
Casein
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.5
OD 450 nm
Fig. 1: Absorption values for the Standards of a RIDASCREEN® CIS-Casein test
R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied,
except that the materials from which its products are made are of standard
quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement
product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the
fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any
damages, including special or consequential damage, or expense arising
directly or indirectly from the use of this product.