上海必优生物科技有限公司

L-LDH

L-乳酸盐 + NAD⁺            丙酮酸+ NADH⁺ + H⁺

GTP

丙酮酸+ L-谷氨酸盐        L-丙氨酸 + 2-酮戊二酸

 

2. 试剂盒内容物

----瓶1内有约30ml溶液，包括：双甘氨肽缓冲液， PH约10.0； L－谷氨酸，约440mg

----瓶2包含210mg的NAD冻干粉

----瓶3包含0.7ml谷丙转氨酶悬浮液，约1100U

----瓶4包含0.7mlL－乳酸盐脱氢酶溶液，约3800U

----瓶5包含L-乳酸盐标准品用于分析质控（实验非必需）

3. 检测溶液的制备

----瓶1，3，4直接使用

----瓶 2用6ml蒸馏水溶解

4. 储存条件

----瓶 1，2，3，4在2-8℃下保存（见标签），使用前需回温至20-25℃

---溶液2在2-8℃下可保存三周，-15～-25℃下可保存二个月

5. 样品处理

----直接取用无色，透明，中性的溶液或按稀释表格稀释后进行检测，体积为1.000ml

----过滤混浊溶液

----加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8-10，并孵育15分钟

----对于有色样品，调整样品孔空白(= 缓冲液、蒸馏水+样品), 把空白放到架子上，调整吸光度为0.000，特别是在加溶液4（L-LDH）前吸光度有升高的话

----对于深颜色的样品溶液可不需稀释或者用PVPP或酰胺配成较高浓度的溶液如：1g/100ml

----粉碎或均质固体和半固体样品，用水抽提或溶解，而后过滤，通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或色素

----用Carrez试剂可脱去样品中的蛋白质

----用热水抽提样品中的脂肪（抽提温度需在脂肪的溶解度之上），冷却后可分离出脂肪，将余下物质转移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分钟而后过滤，热水抽提后用Carrez溶液澄清

 

6. 过程

1. 波长：340nm，Hg365nm或Hg334nm

2. 比色杯：光径1.0cm

3. 温度：20-25℃

4. 最终体积：2.240ml

5. 对照空气（光路上无比色杯）或对照水读取读数

6. 样品溶液：0.3-35ug甘油/检测（体积为0.100-1.000ml样品体积）

7.      具体操作见如下表格

移液	空白（ml）	样品（ml）
溶液1 溶液2 悬浮液3 样品溶液 双蒸水	1.000 0.200 0.020 - 1.000	1.000 0.200 0.020 0.100 0.900
混和，直至前反应完全反应后，约5分钟，读取吸光度值A1，而后加入下列物质：
悬浮物3	0.020	0.020
混和，等反应进行完全后（约30分钟），立即读取样品和空白的吸光度值A2

分别测样品与空白的吸光度值差，而后用样品吸光度值差减去空白吸光度值差可以得到如下公式

△A=(A₂ ―A₁)_样品―(A₂ ―A₁)_空白

若想得到一个足够精确的结果，则测得的吸光度的单位至少为0.100单位。

如果吸光度值差△A在334及340nm下测得的值高于1.000或在365nm下测得的值高于0.500，如此则表明样品溶液中甘油的浓度较高。

需根据稀释表格进行样品的稀释

 

7. 计算

根据以下公式计算浓度

V×MW

C=-----------------------×△A(g/l)

ε×d×v×1000

V=最终体积（ml）

V=样品体积（ml）

MW=被检测物质的摩尔质量

D=光径（cm）

ε=NADH的消光系数

340nm=6.3(1×mmol^-1×cm^-1)

Hg365nm=3.4(1×mmol^-1×cm^-1)

Hg334nm=6.18(1×mmol^-1×cm^-1)

L-乳酸含量计算遵循如下公式

2.240×90.1

C=----------------------------×△A

ε×1.00×0.100×1000

2.781

=----------------×△A（g甘油/l样品溶液）

ε

如果样品溶液是稀释使用的，在计算结果时需乘以稀释系数F

当分析固体或半固体时，测量前需称一定重量配制样品溶液，其结果需按下式计算

C_L-乳酸（g/l样品溶液）

C_L-乳酸=----------------------×100（g/100g）

C_L-乳酸（在样品溶液中）

10. 检测操作说明

被检样品中甘油含量在0.5ug至35ug之间(365nm)或0.3ug至20ug之间（340，334nm）。

为了得到一个足够的吸光度值差，样品溶液的浓度稀释在0.06g/L至0.35g/L之间或0.03g/L至0.2g/L。

稀释表格

每升样品溶液中甘油估计量		用水稀释	稀释倍数
340或334nm	365nm
<0.2g 0.2-2g 2-20g >20g	<0.35g 0.35-3.5g 2.5-35g >35g	- 1﹢9 1﹢99 1﹢999	1 10 100 1000

如果测得的吸光度值△A较低，例如低于0.100，则样品溶液需重新配制，可由下列几种解决方法

1.      可多称出些样品或不要过分稀释。

2.      加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml，当然为了得到相同的最终体积（样品和空白），加入的水的体积就要相应减少。所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。