上海必优生物科技有限公司

VitaFast® Inositol试剂盒简单易用，采用微生物方法，在微孔板中定量检测食品、动物饲料和药品中的肌醇总量（包括添加和原生肌醇）。所有所需的试剂和标准品均包含在试剂盒中。本试剂盒能提供96次检测（包括标准品）。检测结果使用ELISA reader（610－630nm 或者540－550nm）进行读数。

固态和液态样品（包括原生的和富集营养的肌醇）：

                 均质样品、高压灭菌、热提取、（离心）、无菌过滤和稀释。

所需时间：      实验过程..........................................约60分钟

计算…………………………………...2分钟

孵育：          黑暗、30°C条件下44－48小时

标准范围：      0.65－6.5 mg / 100 g (ml)

回收率：        90－105％

Intra-assay CV for standards: < 10 %

Inter-assay CV for standards: < 10 %

 VitaFast® Inositol微孔板检测试剂盒是利用微生物方法，用于定量检测食品、动物饲料和药品中的肌醇总量（包括添加和原生肌醇）。本微生物检测系统符合标准。

肌醇是从样品和稀释提取物中获得的。将稀释了的提取物和肌醇检测培养基加入包被有啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae (ATCC Nr.9080)的微孔中。Saccharomyces cerevisiae的生成状况取决于肌醇的含量。添加肌醇作为标准品或样品混合物，细菌会一直生长直至肌醇被消耗殆尽。孵育应在30°C黑暗条件下进行44－48小时。

Saccharomyces cerevisiae的生长及新陈代谢的强度与肌醇的含量形成关系并可以绘制成标准曲线（通过浑浊度体现）。通过ELISA reader在610—630nm（或者540—550nm）读取结果。

每个试剂盒都包含了能提供96次检测（包括标准品）的试剂。其中包括：

1x 96孔微孔板，包被有Saccharomyces cerevisiae(ATCC Nr.9080)

3x 无菌蒸馏水（30ml），用于培养基、标准品的配制及样品提取物的稀释。

3x 肌醇培养基（固体）

3x 肌醇标准品（固体）

3x 粘性箔

1x 微孔板固定器

注意：请勿在试剂盒标注的有效期之后使用。

 －无菌工作台（在无菌操作时推荐）

 －ELISA reader 610-630nm (540-550nm)

 －黑暗条件下的培养箱，30°C(86 °F)

 －95 °C (203 °F)水浴，或者高压灭菌锅

 －离心机，大约10000 x g（当样品提取液无法过滤的时候使用）

 －灭菌微量移液枪 20 - 200 μl 和 100 - 1000 μl

 －无菌烧瓶 1.5 - 2.0 ml

 －带帽的无菌离心机管 (15ml 和 50 ml)

 －带注射器的无菌滤膜（0.2 μm）

 －双蒸水或去离子水，用于样品提取。

 －检测培养基可能刺激眼睛、皮肤和黏膜

 －完成试验后须根据规章处理使用后的仪器（如：使用高压无菌锅）

试剂盒应存放在2－8°C (35.6 - 46.4 °F)的条件下

样品必须储存在4°C (39.2 °F)、避光条件下。标准品和样品应该进行三次检测（注意：官方标准中推荐三次检测）。未知样品应该用两份提取物的稀释液检测分析。

检测肌醇总量时，样品必须在高压灭菌锅中进行热提取处理。

样品提取时需要1g或1ml均质样品溶解于40ml双蒸水、去离子水或提取溶液中。这相当于样品的提取稀释倍数为40。这个稀释倍数已经包括在标准曲线中（详见质量保证书）。在低浓度的肌醇溶液中，样品使用量可高达5g(5ml)。（在计算结果时应该考虑进去）

在提取过程中试管必须充分振荡至少5次。期间保证离心瓶是完全封闭的。用0.2μm的无菌滤纸过滤1.0－1.5ml样品到1.5－2.0ml的无菌试管中，然后用试剂盒中提供的无菌水在无菌试管中进一步稀释。如果由于固体颗粒或液体浑浊导致过滤不顺利，应在无菌过滤之前先离心（至少在8000 x g的离心力下离心5分钟）。液体样品首先进行无菌过滤，然后稀释，不需要任何热提取过程。样品提取液可以在当天使用，食用之前应避光保存。

样品提取之后，必须用无菌水进一步稀释。稀释倍数由期望的维生素成分除以标准2得到。

提取液的稀释应该在标准曲线的中间区域。因此，浓度应除以标准2

计算：       50 mg / 1.3 mg = 38.5

→结果表明稀释倍数大约为40

→1 : 40 稀释

稀释步骤： 1 : 40

1 : 10 (0.1 ml + 0.9 ml),  1 : 4 (0.25 ml + 0.75 ml)

6.1．肌醇总量（原生肌醇和富含肌醇的营养品）

称取1g（ml）均质样品至50ml无菌离心管，加入20ml双蒸水或去离子水，摇匀，放入高压灭菌锅，在121 °C的条件下进行15分钟（勿盖严）。准确加入双蒸水或去离子水至40ml，之后在95 °C的水浴中提取30分钟。提取过程中试管必须充分振荡至少五次。期间保证离心瓶是完全封闭的。迅速冷却到室温（30 °C以下）。是否进一步稀释则取决于浓度范围。

7.1 准备

装有无菌水的瓶子：推开彩色瓶盖，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，并丢弃。

每个肌醇标准品都足够进行至少3个孔的实验。标准品必须在实验前新鲜制备。

—打开肌醇标准品瓶，开口面向上取出盖子。

—加入Xml（X=详见产品质量保证书或标准品瓶上标签）无菌水（取自试剂盒）至标准品的瓶中。盖好瓶盖，振荡，使其溶解=标准品浓缩液

—取6个无菌试管（1.5~2.0ml），按照下面的表格配制标准品溶液并制成标准曲线。

*提取液的稀释倍数40已经包含在标准曲线中。

肌醇培养基：足够进行至少6条微孔板实验。打开瓶盖，用镊子取出干燥剂，丢掉。

 —加入10ml无菌水（试剂盒中提供）至肌醇培养基瓶中。

 —小心盖好瓶盖，摇匀。

 —在95 °C的水浴中加热至少5分钟，期间振荡至少2次，并保证瓶盖完全封闭。

 —迅速冷却到室温（低于30 °C）

 —使用0.2μm无菌滤纸过滤培养基至15ml无菌离心试管中。

7.2．检测过程

 —将1.0－1.5ml样品用0.2μm无菌滤纸过滤至1.5－2.0ml无菌试管中，并用无菌水（取自试剂盒）进一步稀释。

 —取出需要的微孔板条放在固定器上；把未使用的微孔板条放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新密封好，放在2－8 °C(35.6 - 46.4 °F)的温度下。

 —用移液管吸取150μl肌醇培养基至微孔中。

 —用移液管吸取150μl标准品或稀释样品至指定的微孔中（用标准品或稀释样品溶液冲洗移液管尖）。

 —用粘合箔盖住微孔条或微孔：除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手将粘合箔平压，使其牢固封闭微孔板条。

    注意：保证微孔与粘合箔完全密封，特别注意微孔的边缘部分。

  —用培养箱在30°C的黑暗条件下孵育44－48小时。

7.3．测量

 —再次按压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面，在桌面上振荡，使微生物彻底溶解。

 —对角揭开粘合箔，从右上角开始进行。

 —破坏微孔中液体表面的所有泡沫（用移液管尖或者针）。

 —用ELISA reader 在610－630nm(或者540－550nm)条件下读取混浊度。

—当孵育44－48小时后，微孔板能在冰箱里储存最多48小时，必须在这个时间段内测量混浊度。

推荐在计算结果时使用必发公司提供的相关配套软件。

检测结果在以下条件下准确：

 —OD空白 < OD标准1

 —OD标准5 > 0.6OD

样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中（详见质量保证书）。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数和不同的样品重量。

                     从标准曲线上读取的浓度 x 稀释倍数

肌醇     =    —————————————————————

(mg / 100 g)                    样品总量 g（ml）

(mg / 100 ml)

样品重量：                    1g

样品提取液的稀释：             1：40(不需要考虑的)

样品提取物的稀释溶液：         1：40（必须考虑的 ）

从标准曲线上得出的溶液浓度：   1.3mg 肌醇 / 100g(ml)

1.3 * 40 / 1 = 52 mg 肌醇/ 100g(ml)

未知样品应该用两份提取物的稀释液检测(误差应该小于10％)。如果在更高的稀释液中肌醇含量更多，则可能存在抑制剂，比如重金属或者抗生素。